生物過程中溶液中濃度測量技術(shù)比較

生物制藥制造涉及復雜的工藝步驟，嚴格的生產(chǎn)條件能最大限度地提高生物產(chǎn)品的產(chǎn)量、純度和質(zhì)量。近年來，過程分析技術(shù)(PAT)越來越多地被用于實時監(jiān)控關(guān)鍵的過程和性能參數(shù)。PAT技術(shù)能更好地控制生產(chǎn)條件，工藝流體中的溶液濃度是許多生物處理步驟中實現(xiàn)成品質(zhì)量一致性所需的重要參數(shù)

濃度測量的關(guān)鍵需求

許多生物制藥制造工藝步驟需要測量溶液中溶質(zhì)的濃度。對于上游過程，進料和生物反應(yīng)器中成分的濃度對于細胞代謝和生長非常重要，同時要確保可重復操作；在下游過程中，需要大量的溶液(包括緩沖液)來進行層析和超濾/透析(UF/DF)步驟。制備不當?shù)娜芤嚎赡軙ο掠芜^程產(chǎn)生嚴重的負面影響(例如，產(chǎn)品無法與色譜柱結(jié)合或不正確地配制原料藥)。

因此，溶質(zhì)濃度的測量是溶液制備過程中的一個關(guān)鍵步驟，確保溶液在引入過程之前已經(jīng)被正確地配制。此外，在色譜運行期間，通過對溶液進行在線監(jiān)測，可以提供用于生成鹽梯度的輸入控制參數(shù)，進行在線稀釋緩沖液，并監(jiān)測在色譜運行的每個步驟(例如平衡、洗滌和洗脫)中是否使用了正確的溶液。

工藝過程中流體濃度的測量在清潔操作中十分重要，對清潔液進行濃度測量以確定清潔溶液中酸、堿或清潔劑濃度是否處于適當水平。未進行該測量可能會導致清潔不充分、系統(tǒng)組件損壞以及系統(tǒng)停機時間延長。濃度測量還用于監(jiān)測清潔過程所需要沖洗系統(tǒng)的水中的溶質(zhì)濃度，可以檢測清洗過程中清潔劑是否去除。

濃度測量技術(shù)概覽

要讓生物制藥制造商相信上游和下游生產(chǎn)過程中使用和產(chǎn)生的工藝流體是符合規(guī)定的濃度，擁有易于使用、有效且高效的濃度測量方法非常重要。理想的技術(shù)必須是可靠的，并且提供高精度和可重復性以及快速響應(yīng)時間。

電導率是衡量溶液傳導電流能力的指標(1)。它可以通過在電極之間施加電壓，測量產(chǎn)生的電流，并確定溶液的電阻率(由此計算電導率)來測量。溶質(zhì)在溶液中導電的程度取決于其離子特性和濃度。因此，測量電導率是確定離子溶液濃度的好方法。

但是這種方法在測量含有非離子和弱離子物質(zhì)的溶液濃度的能力方面受到一定限制，包括許多生物處理溶液中的成分。使用電導率來精確測定許多生物制藥溶液中成分的濃度相對困難。

溶液的pH值是衡量溶液酸度或堿度的指標。具體來說，pH值測量水合氫離子的濃度(2)。因此，它是解離時產(chǎn)生水合氫離子的物質(zhì)的水溶液濃度的有效指標。

但對于不產(chǎn)生水合氫離子的工藝流體，它的用途有限。

滲透壓是一種基于由于給定溶質(zhì)(3)的存在而導致的溶液凝固點變化(或凝固點降低)的濃度測量方法。溶質(zhì)使溶液的凝固點降低到比純?nèi)軇┑哪厅c低的值。一般情況下，溶質(zhì)濃度越大，凝固點降低越大;因此，濃度的大小與抑制程度相關(guān)。與電導率和pH值通常用作在線技術(shù)不同，滲透壓是一種離線測量技術(shù)，不能提供實時信息。

折射率:當光線從一種介質(zhì)進入另一種介質(zhì)時，由于光在每種介質(zhì)中傳播速度的變化，光線會彎曲成一定角度。一種介質(zhì)的折射率(IoR)是真空中的光速與該介質(zhì)中的光速之間的比率(4)。不同濃度的溶質(zhì)溶液具有不同的折射率。因此，確定溶液的IoR可以直接測量溶液的濃度。

在傳統(tǒng)的折射計中，光源照射在樣品上，然后光線穿過溶液。這樣，分析人員就可以確定光的傳輸。然而，使用這種方法的結(jié)果可能會受到溶液中的濁度以及光的衍射和吸收的影響(1)。

一種較新的使用發(fā)光二極管(LED)反射IoR技術(shù)。來自LED的光線照射到光學窗口上，該光學窗口與待分析的工藝流體或產(chǎn)品溶液接觸。光在臨界角(θ_c)反射出光學窗口，在那里它被折射到流體。這個角度可以通過使用光電二極管陣列探測器分析反射光來確定。臨界點取決于溶液濃度。因此，分析人員可以迅速檢測到濃度的變化。使用這種方法測試的結(jié)果不受溶液濁度或衍射和光吸收的影響。

與電導率和pH值不同，溶液的折射率與它的電荷情況或酸性無關(guān)。由于該技術(shù)可以非常快速地確定溶液的IoR，所以適用于實時數(shù)據(jù)的在線分析，可以對工藝變化立即做出響應(yīng)。此外，IoR監(jiān)測很容易從實驗室擴展到商業(yè)生產(chǎn)，而不會對精度有所損傷。這使得該技術(shù)適用于需要濃度監(jiān)測的生物制藥應(yīng)用。

研究目的、材料和方法

這項研究的主要目的是比較電導率、IoR和滲透壓的性能，以測量生物制藥生產(chǎn)中經(jīng)常使用的不同類型溶液的濃度。北卡羅來納州立大學的生物制造培訓與教育中心(BTEC)進行了這項分析技術(shù)評估。

為了評估，我們準備了幾種生物制藥加工中常用的不同水溶液(表1)。我們測量了每種溶液的電導率、IoR和滲透壓。我們選擇的溶液包括一系列不同濃度的含有不同溶質(zhì)的液體。這些溶質(zhì)可分為離子型、非離子型和有機緩沖液。我們在生物制藥過程中可能使用的pH值條件下制備有機緩沖溶液，不需要調(diào)整pH值。

對于每種溶液，我們分別使用220型電導率儀(Denver Instruments)、BT128型IoR濃度監(jiān)測儀(Entegris)和3320型微滲透儀(Advanced Instruments)測量電導率、折射率和滲透壓。我們繪制了每種測試方法(電導率，IoR和滲透壓)對每種溶液濃度的響應(yīng)。線性響應(yīng)是一個重要的方法屬性，因為它允許簡單地量化溶液濃度。因此，我們使用響應(yīng)的線性度來評估方法的有效性。

結(jié)果與討論

我們將在下面討論實驗結(jié)果。

離子濃度:圖1和圖2顯示了NaCl溶液在0.1M到2 M濃度范圍內(nèi)的結(jié)果，每種方法都給出了合理的線性響應(yīng)。但是，由于樣品的凝固點過低(超出了本研究所用的滲透計的測量范圍)，高濃度NaCl(2M)溶液的滲透壓無法測定。

我們對氫氧化鈉溶液進行了類似的測量(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，與NaCl的結(jié)果一樣，NaOH(2 M)的最高濃度的滲透壓超出了滲透計的范圍。此外，2M NaOH的電導率也超出了量程(300 mS/cm)的范圍。因此，無論是電導率還是滲透性都無法提供所研究的濃度范圍內(nèi)的讀數(shù)。相比之下，IoR在整個濃度范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。

圖1：NaCl：電導率和折射率性能	圖2：NaCl：滲透壓和折射率性能

非離子溶液:圖3和圖4顯示了乙醇溶液的電導率、IoR和滲透壓測量。沒有一種檢測方法在研究的濃度范圍內(nèi)(10-75v/v)提供線性響應(yīng)。然而，IoR方法提供了三種測試方法中較好的結(jié)果。正如預期的那樣，乙醇溶液的電導率值相當?shù)停c濃度不是線性相關(guān)。當酒精濃度≥0.25 v/v時，溶液不結(jié)冰。所以我們無法確定它們的滲透壓。與離子溶液一樣，IoR在整個濃度范圍內(nèi)具有最佳的線性響應(yīng)。

對聚山梨酯80溶液的測量結(jié)果與乙醇溶液相似。在0.5-5v/v濃度范圍內(nèi)，聚山梨酸酯80溶液的IoR和滲透壓測量值呈線性(數(shù)據(jù)未顯示)。與乙醇的結(jié)果不同，聚山梨酸酯80的電導率和濃度的圖根據(jù)線性最小二乘擬合的決定值系數(shù)顯示出一定的線性。由于聚山梨酯80是非離子型的，這個結(jié)果是出乎意料的。然而，測量的電導率值較低(均為5μS/cm以下)，在這個低范圍內(nèi)的測量精度相當?shù)汀?/p>

圖3：乙醇：電導率和折射率性能	圖4：乙醇：滲透壓和折射率性能

有機緩沖液：在不同的pH值下，3種有機緩沖液(2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、2-氨基-2-羥甲基丙烷-1，3-二醇(Tris)和2-[4-(2-qiang乙基)哌qin-1-基]乙磺酸(HEPES))的測定結(jié)果相似。圖5-8顯示了未調(diào)整和調(diào)整到pH 8的Tris溶液的數(shù)據(jù)。在10-500 mM的濃度范圍內(nèi)，pH為8的Tris溶液對所有測量方法都呈線性響應(yīng)。值得注意的是，在沒有調(diào)整pH的情況下，電導率和濃度之間的關(guān)系不是線性的。這些有機緩沖液只是弱離子的，在低電導值時，準確度和精密度會受到影響。用酸調(diào)節(jié)pH到8，此時的Tris溶液的電導率數(shù)據(jù)與濃度呈線性關(guān)系，這是由于調(diào)節(jié)pH用的酸的關(guān)系（HCl）

圖5：Tris無pH調(diào)節(jié)：電導率和折射率性能	圖6：Tris無pH調(diào)節(jié)：滲透壓和折射率性能
圖7：Tris pH值8：電導率和折射率性能	圖8：Tris pH值8：滲透壓和折射率性能

表2總結(jié)了所使用的每種分析方法的決定系數(shù)(R2)。R2是數(shù)據(jù)與擬合線性回歸線的接近程度的統(tǒng)計度量(5)。該表清楚地表明，電導率是確定離子溶液和有機緩沖液濃度的合適方法。然而，這不是一種適合于測定非離子溶液濃度的方法。

表2中的結(jié)果還表明，雖然滲透壓適用于本研究評估的大多數(shù)溶液，但由于缺乏凍結(jié)，較高的溶質(zhì)濃度可能導致滲透壓值不確定。還應(yīng)該注意的是，滲透壓是一種離線方法，不能用于在線分析。值得注意的是，表2表明，在所有濃度下，只有IoR對所有溶液都有線性響應(yīng)。

我們觀察到所有方法都有良好的精度，盡管導電性能測試的重復性略低于IoR和滲透性測試，特別是在低導電性能值時。具體來說，電導率測量需要頻繁校準，讀數(shù)穩(wěn)定需要時間。

有效的濃度測量與IoR法

生物制藥生產(chǎn)中的質(zhì)量控制是生產(chǎn)安全有效的生物藥物的關(guān)鍵。生物制藥生產(chǎn)中使用的工藝流體的準確濃度測量對于確保一致的加工，產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量至關(guān)重要。在線PAT方法的開發(fā)提高了公司實時監(jiān)測和控制生物過程的能力。

對于濃度測量，本研究表明IoR技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的濃度測量方法，如電導率和滲透壓。IoR方法對所有測試溶液的濃度都產(chǎn)生了優(yōu)秀的線性相關(guān)性。由于IoR能夠?qū)ι镏扑幧a(chǎn)中常用的許多不同類型的試劑在更寬的濃度范圍內(nèi)進行有效的實時濃度測量，具有很高的準確度和精度，因此，它在實時在線測量工藝流體濃度方面具有很大的潛力。

參考文獻

1 Electrical Conductivity(o) and Resistivity (p).US Environmental Protection Agency.

2 CADDIS:Tbe Causal Analysis/Diagnosis Decision Information System, Volume 2:Sources, Stressors, and Responses; pH.US Environmental Protection Agency

3 Lobdell DH.Osmometry Revisited;

4 Refractive Index Theory. University of Toronto Scarborough; 

5 Frost J. Regression Analysis: How DoI Interpret R-squared and Assess the Goodnessof-Fit? Tbe Minitab Blog 30 May 2013;